項(xiàng)目背景

維生素D是脂溶性類固醇類衍生物，主要包括VD₂（麥角鈣化醇）及VD₃（膽鈣化醇）。在肝臟中，維生素D被羥基化為25羥基維生素D，多與維生素D結(jié)合蛋白（VDBP）結(jié)合，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)；25羥基維生素D是維生素D在血液中主要運(yùn)輸形式，濃度高且穩(wěn)定，半衰期長(zhǎng)，其濃度被認(rèn)為是評(píng)價(jià)維生素D水平的最佳指標(biāo)^[1]。

據(jù)估計(jì)，全世界大約有30%-50%的兒童和成年人的血清25羥基維生素D缺乏，在妊娠婦女中尤為明顯^[2,3]。

原料難點(diǎn)

25羥基維生素D作為一個(gè)臨床有廣泛需求的項(xiàng)目，我們?cè)诎l(fā)光、免疫熒光等平臺(tái)原料的研發(fā)過(guò)程中，遇到很多的困難，主要集中在以下方面：

l  小分子抗體的開(kāi)發(fā)；

l  25(OH)D特異性抗體的開(kāi)發(fā)；

l  兼容25(OH)D₂、25(OH)D₃、3-epi-25(OH)D₃抗體的開(kāi)發(fā)；

l  25(OH)D₂、25(OH)D₃等特異性抗體的篩選；

l  抗體原料要有足夠的定量范圍，覆蓋臨床上“不足”與“過(guò)量”；

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研發(fā)工作，同仁心的研發(fā)團(tuán)隊(duì)目前已成功開(kāi)發(fā)了兩組配對(duì)，基本上解決了上述各問(wèn)題。

同仁心25羥基維生素D原料概況

在化學(xué)發(fā)光、酶聯(lián)免疫、熒光紙條等免疫平臺(tái)，我們均推薦采用”競(jìng)爭(zhēng)法”檢測(cè)本項(xiàng)目，根據(jù)具體檢測(cè)目標(biāo)不同，我們推薦的原料組合如下：

組合1：抗體1C7可以同時(shí)識(shí)別25(OH)D₂及25(OH)D₃，配套抗原BSA-25(OH)D同時(shí)偶聯(lián)了25(OH)D₂及25(OH)D₃，該組合模式可以用于檢測(cè)樣本中的總25(OH)D;

組合2：抗體17E11能特異性識(shí)別25(OH)D₃，不存在和25(OH)D₂的交叉反應(yīng)性，配套抗原BSA-25(OH)D₃僅偶聯(lián)25(OH)D₃，該組合可以用于特異性檢測(cè)樣本中的25(OH)D₃。

同仁心25羥基維生素D原料性能

?  VD₂&VD₃特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果

數(shù)據(jù)可見(jiàn)，1C7對(duì)VD₂和VD₃都有明顯的競(jìng)爭(zhēng)效果；17E11僅對(duì)VD₃有競(jìng)爭(zhēng)效果。

?  靈敏度及檢測(cè)范圍

兩種組合模式，原料都可以實(shí)現(xiàn)3-300ng/ml范圍內(nèi)的準(zhǔn)確定量。（Roche試劑定量范圍：3-70ng/ml； Abbott試劑定量范圍：8-160ng/ml）

      ?  交叉反應(yīng)性

注：Roche/Abbott為試劑說(shuō)明書數(shù)據(jù)

?  對(duì)照原料的比較

科研人員選取了市場(chǎng)上部分主要的VD抗體，連同同仁心的抗體，進(jìn)行了初步的性能評(píng)價(jià)：

在標(biāo)記濃度相同的情況下，對(duì)抗體進(jìn)行梯度稀釋，已考察抗體的活性：

可見(jiàn)，同仁心的抗體活性要明顯高于對(duì)照抗體。

此外，在競(jìng)爭(zhēng)效果相近的情況下，比較了各組抗體的使用量：

數(shù)據(jù)可見(jiàn)，競(jìng)爭(zhēng)效果相當(dāng)?shù)那闆r下，同仁心抗體使用濃度更低。

應(yīng)用中的主要注意事項(xiàng)

1.     體系中鹽濃度建議≤50mm；

2.     體系中避免使用小牛、羊血清等動(dòng)物來(lái)源，組分不明物質(zhì)，避免外源25OHVD或動(dòng)物其他蛋白干擾評(píng)價(jià)結(jié)果。

參考文獻(xiàn)               

[1] Holick MF Chen TC. Am J Clin Nutr 87(suppl),1080S – 1086S, 2008.

[2] Tao M, J Maternal Fetal Neonatal Med., 2012 Mar;25(3):237-9

[3] 《中國(guó)人群維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況》，吳光馳，中國(guó)婦幼衛(wèi)生雜志，2010,1（1）：51-54

[4] 《維生素D與成年人骨骼健康應(yīng)用指南（2014年標(biāo)準(zhǔn)版）》，中國(guó)老年學(xué)學(xué)會(huì)骨質(zhì)疏松委員會(huì)維生素D學(xué)科組專家委員會(huì)：中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2014